작성자:오현우박사

작성자 : 오현우 박사

전자현미경의 발달

보이지 않는 세계를 관찰하고자 하는 인류의 꿈은 현미경 발달의 역사와 더불어 조금씩 실현되어 왔다. 17세기에 영국 왕립협회의 Hook이 복합렌즈 방식으로 광학현미경을 발명하여 물리학, 생물학 분야에서 새로운 기원을 열었다.
그 후 현미경의 성능은 계속 향상되어 19세기 말에는 이미 광학현미경으로 도달할 수 있는 한계인 2000배 배율의 성능을 나타내는 현미경이 제작되었다.
1931년 독일의 Ruska가 광학현미경의 한계를 뛰어 넘는 전자현미경을 처음으로 만든 뒤 그 성능은 계속 향상되어 전자현미경은 오늘날에는 의학, 생물학 및 재료분야의 연구에서는 없어서는 안될 필수 불가결한 장비가 되었다. 특히 의학, 생물학 분야에서 전자현미경이 끼친 영향은 너무나 크기 때문에 20세기에 발명된 연구장비 중 가장 값진 것으로 평가되고 있다.

전자현미경의 종류

생물체를 연구하는 데 사용하는 전자현미경에는 크게 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope)과 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope)의 두종류가 있다.

투과전자현미경(TEM)은 광학현미경과 그 원리가 비슷하여 전자선이 표본을 투과하고 일련의 전기자기장(electromagnetic field) 또는 정전기장(electrostatic field)을 거쳐 형광판이나 사진필름에 초점을 맞추어 투사됨으로써 원하는 상을 얻게 된다. 투과전자현미경은 확대율과 해상력이 뛰어나 광학현미경으로는 관찰할 수 없는 세포 및 조직의 미세한 구조를 관찰할 수 있으며, 단백질과 같은 작은 구조도 볼 수 있다. 생물학적 표본에서 사용되는 전자현미경의 분해능은 약 0.2nm(side entry), 0.14nm(top entry)이며 최근에는 고전압(500∼1,000KV)을 사용하는 투과전자현미경이 개발되어 비교적 두꺼운 조직 표본도 관찰이 가능해 졌으나 아직은 크게 활용되지 않고 있다.

주사전자현미경(SEM)은 보다 최근에 개발되었으며 투과전자현미경과는 다소 다르다. 주사전자현미경은 전자가 표본을 통과하는 것이 아니라 초점이 잘 맞추어진 전자선을 표본의 표면에 주사하고, 주사된 전자선이 표본의 한 점에 집중되면 일차전자는 굴절되고 표면에서 발생된 이차전자가 검파기(detector)에 의해 수집된다. 그 결과 생긴 신호들이 여러 점으로부터 모여들어 음극선관(cathod ray tube)에 상을 형성하게 된다. 주사전자현미경의 특징은 초점이 높은 심도를 이용해서 비교적 큰 표본을 입체적으로 관찰할 수 있다는 것이다.

시료제작

전자 현미경을 이용하여 일련의 정보를 얻기 위해서는 거의 대부분 생물 시료가 일정한 과정을 거쳐야 하는데 이를 간단히 살펴보면 다음과 같다.

1) 투과전자현미경(Section) ; 생물시료의 내부 구조 관찰(ex: 핵, 미토콘드리아, 엽록체 등)

①고정 ( Fixation ) : 조직이나 세포의 구조와 내용물을 살아 있을 때의 상태대로 보존하면서 죽이는 과정으로 미세 구조 보존에 가장 중요한 첫 단계이다.
②탈수 ( Dehydration ) : 조직을 단단하게 지탱해 주는 매몰 물질 대부분이 수용성이 아니므로 조직 내에 있는 모든 수분을 제거하고 유기용매로 대체시키는 과정이다.
③매몰 ( Embedding ) : 조직을 채우고 있는 유기 용매를 매몰 물질들의 단위체 혼합액으로 다시 대체 시킨 후 가열하여 중합 시켜 조직을 단단하게 감싸준다.
④절편제작 ( Section ): 전자빔이 투과할 수 있는 얇은 절편(보통 80-100nm)을 만드는 과정으로 숙련이 가장 많이 요구된다.
⑤염색 ( Staining ) : 위에서 자른 절편을 grid 위에 부착 시킨 후 조직의 contrast를 높여 주기 위하여 중금속으로 염색한다.
⑥이렇게 준비된 표본 절편을 전자 현미경으로 관찰한다.

관찰된 사진

세균을 Section 하여 TEM으로 관찰한 사진

2) 투과전자현미경(Negative staining) ; 주로 미생물의 Flagella 관찰

고체배지나 액상배지에서 키운 미생물을 일정량 채취하여 1% Uranyl acetate 혹은 1% PTA(Phosphotungustic acid)로 염색하여 전자현미경으로 관찰한다.

관찰된 사진

세균을 TEM negative staining 하여 관찰한 모습

3) 주사전자현미경 ; 생물시료의 외부형태 관찰 (ex: 세균의 일반적인 외부형태, 곰팡이나 방선균의 포자형태, 꽃가루의 모습 등)

①고정 ( Fixation ) : 조직이나 세포의 구조와 내용물을 살아 있을 때의 상태대로 보존하면서 죽이는 과정으로 미세 구조 보존에 가장 중요한 첫 단계이다.
②탈수 ( Dehydration ) : 조직을 단단하게 지탱해 주는 매몰 물질 대부분이 수용성이 아니므로 조직 내에 있는 모든 수분을 제거하고 유기용매로 대체시키는 과정이다.
③건조 ( Drying ) : 조직 내의 수분을 제거하는 것으로 건조시킬 때의 형태변화를 최소한으로 줄이기 위하여 주로 액체 CO₂를 이용한 임계점 건조법(Critical point drying)을 사용한다.
④고정 ( Mounting ) : 임계점 건조가 끝난 시료를 시료대(Stub) 위에 붙이는 과정으로, 이때 사용되는 접착제로는 Silver paste, Carbon paste, 목공용 본드, 양면 테이프 등이 이용된다.
⑤증착 ( Coating ) : 생물 시료 자체는 전도성이 없기 때문에 금속이나 Carbon으로 증착을 실시한다.
⑥이렇게 준비된 생물 표본을 전자 현미경으로 관찰한다.

관찰된 사진

미생물을 주사현미경으로 관찰한 사진
(bar means : 10 μm)

관찰된 사진

꽃가루를 주사현미경으로 관찰한 사진
(bar means : 10 μm)

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